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摘要: MSCs直播公开课精彩答疑,你的答案都在这,文末更有彩蛋等你揭晓!

公开课后记 | 间充质干细胞直播答疑

计划赶不上变化,原定 8 月 2 日晚的微信公开课《间充质干细胞培养、鉴定、分化、研究一体化方案》,在建微信群第一日就被热情的报名刷爆了,刷爆了,爆了。


为保证每一位报名者都能如期参加课程,Bio-Techne 转战千聊直播间,获得数千人次的观看,直播间精彩回顾点击文末阅读原文,更有双重彩蛋等你揭晓!



直播课程火力全开,由 Bio-Techne 技术支持专家刘振博士主讲,从间充质干细胞(MSCs)的发展历程、定义标准着手,延伸到其多向分化潜能及来源,以 MSCs 的分离-鉴定-培养-诱导分化为纲要,深入浅出地诠释了 MSCs 研究完整解决方案,生动形象地描述了 MSCs 实验操作流程。


直播现场互动热烈,可惜刘博士不能成为千手观音,也不能超长待机,活动后期,刘博士为各位看官一一解惑,看看是否有你的关注点↓


Dr. Liu 答疑时间,你的答案在不在?


MSCs 分离


提问骨髓分离干细胞的时候是把两头的干骺端剪掉冲洗吗?


Dr. Liu:对的,使用 1 mL 针头冲洗至骨头发白,冲下的细胞要过细胞筛。


提问:脐带间充质干细胞用组织块贴壁法组织迁移出来很慢,10 天了有时还看不到细胞,可能存在什么问题?能够通过冻干来浓缩间充质干细胞的培养基上清吗?用途是提外泌体。


Dr. Liu:如果采用组织块贴壁迁移也最好用胶原酶处理一下,去掉表面粘膜。另外,为了贴住可加盖小玻璃片压住组织块。注意组织提取剪碎在低温下进行。注意避免污染。


外泌体分离有专门的试剂盒和机器,冻干不适合。


提问:用贴壁法分离 MSCs 时,胰酶消化程度会对 MSCs 表面抗原有多大的损伤?这些损伤会影响流式分析结果甚至影响细胞干性吗?


Dr. Liu:Trypsin 的质量、浓度和消化时间都会影响细胞的生长状态,甚至干性。


MSCs 培养


提问:血清一般不是无支原体的么,干嘛用无血清。


Dr. Liu:有血清和无血清培养的区别不在于是否含有支原体,而是根据实际应用需求。


无血清培养基,成分明确能更好控制批间差异。


提问:用无血清培养基培养骨髓间充质干细胞如何终止消化?


Dr. Liu:对于无血清培养的 MSCs,终止消化时可以加 Trypsin 抑制剂。


提问:如果是用含血清培养基培养的话,要对 MSC 进行加药处理时需要换成无血清培养基或是减少血清含量吗?


Dr. Liu:需要根据加的药物是否是本身血清中含有的,还有加药的过程是否对血清有特殊要求,如血清饥饿。


提问:细胞培养的过程中,血清的相对多少对细胞培养有关系不?比如百分之十和百分之十五。


Dr. Liu:有差别,血清浓度高会加快细胞生长, 但过高容易引起细胞分化。


提问:小鼠骨髓间充质干细胞怎么用含 EDTA 的胰酶怎么很难消化下来?


Dr. Liu:最好在镜下确认下是否是成纤维细胞形态,因为 MSCs 是很容易用胰酶消化的。


提问:请问大鼠骨髓间充质干细胞传代至 3 代以后就出现老化了,有什么好的解决办法吗?


Dr. Liu:在确定分选细胞纯度和状态情况下,优化培养条件,包括传代需要注意的一些事项。


提问:大鼠骨髓间充质干细胞原代就老化的很厉害,会是什么原因呢?


Dr. Liu:注意取细胞大鼠的年龄,另外,细胞操作过程中也需要注意,比如传代 Trypsin 消化处理等。


提问:请问如何判定前期,中期,后期?


Dr. Liu:通过细胞分子表面 marker,可用流式鉴定在传代过程中哪些 marker 发生了变化,结合分化效率综合判断。


提问:请问我现在养的牙髓干细胞当中有不少的间充质细胞,如何去除这些杂细胞?


Dr. Liu:待有一定数量细胞后采用 FACS 方法进行分选。


提问:原代细胞传代时,接种密度应该多大合适?细胞扩增速度慢的问题怎么解决呢?培养过程中添加 EGF 可以促进生长么?会影响它分化不?


Dr. Liu:与细胞本身的状态有关,如果是含有牛血清的培养基进行培养,需要特别注意血清的质量,也可以选用无血清培养基。


接种密度在 20~30%。EGF 可能会影响 MSC 分化。选择优质的培养基可以帮助细胞维持相对长的良好状态。


提问:请问复苏后不贴壁是什么原因?请问细胞密度和生长速度的关系如何?


Dr. Liu:冻存条件不佳和复苏不注意都可能造成复苏的细胞死亡或不贴壁。


过密和过稀都会影响细胞生长速度。原代细胞要求不能长满,80% 左右进行传代,传代应避免反复传代,否则可能会丢失形态和干性。


提问:培养瓶养间质干长的很慢,需要加什么因子促进生长呢?


Dr. Liu:正常情况下培养 hMSCs 一周时间就可以传一代,细胞生长太满要注意培养条件和细胞状态。


提问:干细胞原代培养需要加促纤维生长因子吗?


Dr. Liu:不建议随意添加生长因子,因为添加生长因子会影响 MSCs 的分化潜能。


提问:原代间充质细胞如不诱导分化,一般可在体外传几代且依然保持干性?


Dr. Liu:原代发文章要求比较早的时候,不同种属有一定的差异,人 MSCs 相对小鼠可传代次数要多一些,但仍然需要控制在 10 代以内。


提问:细胞融合度达到 80% 以上,去除血清完全培养液,更换无血清非完全培养液至细胞融合度达到 95%,这样会对细胞造成影响吗?多次传代后细胞会出现状态不佳的情况吗?


Dr. Liu:会影响,多次传代也会出现细胞状态不佳,包括出现衰老。


提问:如果说间充质干细胞的研究需要用 10 代以内的细胞,那我们还可以称它们是细胞系吗?请问,间充质干细胞一般最多能传代到第几代,还依然有干性?


Dr. Liu:不能称之为细胞系,细胞系一般指原代细胞分离经过反复传代或其他处理直至可以无限增殖 immortalized 的细胞,这个过程中细胞的基因组(包括表观组)实际上与原代细胞都明显不同,这就是为什么在细胞功能检测方面大家倾向于使用代数较低的原代细胞。


提问:原待间充质干细胞冻存后复苏的存活率高吗?


Dr. Liu:冻存复苏得当,90% 以上复苏基本是可以达到的。


MSCs 诱导分化


提问:干扰素γ 对间充质干细胞的分化有什么影响?


Dr. Liu:有报道表明 IFNγ可以促进 MSCs 分泌一系列的生长因子,抑制 MSCs 分化(例如向 Osteoblast 分化),但是影响程度需要看实际培养条件。


提问:请问贵公司有诱导破骨的因子吗?


Dr. Liu:破骨细胞分化采用 M-CSF、RANKL 联合诱导,我司有人、小鼠、大鼠等等适合不同种属的 OC 前体细胞定向诱导成 OC。


提问:我们养的羊膜间充质,感觉有网状细胞,是分化了吗?


Dr. Liu:未分化的细胞显微镜下观察应该是立体感强、Fibroblast 形态、生长正常。


提问:人干细胞成软骨分化选 TGFβ3 还是 TGFβ1,要不要加 BMP2?


Dr. Liu:属于 TGF 家族的 TGFβ3 和 TGFβ1 联合其他诱导试剂都可以有效诱导软骨分化,诱导时不用加 BMP2。


提问:请问分化成神经元细胞的可能性大吗?


Dr. Liu:体外可定向诱导成为神经元。


提问:成骨诱导液中抗坏血酸浓度是 50 ug 还是 uM 啊?


Dr. Liu:50 ug/mL


提问:请问做间充质干细胞的神经细胞诱导分化,生长因子法诱导一般诱导多少天比较合适?


Dr. Liu:可以参照课程中提供的 bGFG+Forskolin 组合 protocol,根据该 Protocol 需要 14 天。当然,如有有其他的 protocol,也可以参照试验。


MSCs 质粒转染/病毒感染


提问:MSCs 如何转染质粒?


Dr. Liu:转染可以采用脂质体方法转染。


提问:MSC 转染质粒如何提高转染效率?MSC 3-5 代做质粒转染会不会容易一点?


Dr. Liu:处于对数生长期的转染更容易成功。


提问:我要做脐带间充质干细胞稳定表达某几种质粒,是不是慢病毒比较好,可是免疫原性什么的很需要考虑,我们本来做的是电转染但是很难稳定表达。


Dr. Liu:慢病毒方法比较好。


提问:传代的 ASC 要做 miRNA 抑制转染,可以用脂质体 2000 吗?


Dr. Liu:细胞状态较好的情况下,比如对数期,是可以用 Lipo2000 来进行转染的。


其他 MSCs 研究相关


提问:请问间充质干细胞分泌的囊泡数量多吗?还是跟培养方法和分离纯化有很大关系?


Dr. Liu:未遇见 MSCs 分泌囊泡情况,请注意细胞状态。


提问:课程中提到内膜中也有间充质干细胞吗?


Dr. Liu:截止到目前,报道身体组织有很多地方都能分离出 MSCs,包括 stromal membrane 在内。


提问:MSC 表达 oct4,nano g 么?


Dr. Liu:不表达,一般 ES 或者 iPS 会表达 oct4,nano g。


提问:MSCs 被包载在海藻酸钠内,请问我怎么保存?


Dr. Liu:长期保存细胞,必须让细胞在冻存液置于液氮中。


iPSC/Organoid 直播,你约不约?


课程中,不少热心观众表示对后续的直播课程 hin 感兴趣,点击阅读原文关注 Bio-Techne 直播间,iPSC、Organoid 课程即将开演。


? Best tools for induced pluripotent stem cells(iPSC) research


主讲人: 陈锐 Bio-Techne China 应用专家


? 3D culture: Organogenesis in a dish


主讲人: 王佳军 Bio-Techne China 应用专家


听讲座拿大礼,你就是那个幸运儿


如果上文中没有你寻找的答案,还可参加「听讲座,拿大礼」活动,留下问题,刘博士将为你解惑,答案会在活动结束后反馈到你留的邮箱中,活动截止时间 8 月 24 日。


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文中图片来源于Bing


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